Genome Research and Education Center of SibFU

Секвенатор MiSeq, Illumina (генетический анализатор)

Настольный интегрированный инструмент для NGS, включающий в одном приборе блоки для подготовки образцов (образования кластеров), секвенирования и обработки данных и интерфейс для управления. 

Принцип секвенирования основан на технологии Solexa, включающей обогащение методом bridge-ПЦР на проточном чипе, секвенирование методом синтеза (SBS) с использованием флуоресцентно-меченных нуклеотидов и детекцию света флуоресценции от кластеров ДНК.

Основные применения:

  • ресеквенирование ампликоновых библиотек;
  • проверка результатов клонирования и генной модификации;
  • мультиплексное высокопроизводительное секвенирование малых геномов (например, микроорганизмов);
  • таргетное высокопроизводительное секвенирование геномов для анализа генетически-ассоциированных болезней;
  • поиск мутаций;
  • HLA-типирование;
  • секвенирование малых РНК;
  • эпигенетические исследования, анализ профиля метилирования;
  • целевое ресеквенирование и секвенирование de novo и т. д.

Суммарная производительность, п.н. при длине чтения, п.н. за время запуска:

— от 540 до 610×106 при 1×36 за 4 ч.;

— от 750 до 850×106 при 2×25 за 5,5 ч.;

— от 3,0 до 3,4×109 при 2×100 за 16,5 ч.;

— от 4,5 до 5,1×109 при 2×150 за 24 ч;

— от 7,5 до 8,5×109 при 2×250 за 39 ч;

  • максимальная длина чтения (одноконцевого / парноконцевого), нуклеотидов — 250/500;
  • стандартные длины считываемых фрагментов ДНК при чтении с обоих концов: 2×25, 2×50, 2×75, 2×100, 2×150, 2×250;
  • количество успешных прочтений за запуск: — от 12 до 15×106 для одноконцевых чтений в н. в., к концу 2013 г — от 22 до 2×106; — от 24 до 30×106 для парных прочтений в н. в., к концу 2013 г — от 44 до 50×106;
  • процент оснований в каждом прочтении, точность чтения для которых превышает 99,9 % (Q30) при длине чтения, п.н.: — 90 % при 1×36; — 90 % при 2×25; — 85 % при 2×100; — 80 % при 2×150; — 70 % при 2×250; — 70 % при ожидающейся к концу 2013 года длине чтения 2×300;
  • возможности мультиплексирования за счет смешивания образцов в одной пробе — до 96 с помощью комбинации мультиплексных идентификаторов с каждого конца при парно-концевых чтениях (8×12);
  • реагенты TruSeq реализуют метод обратимого терминального включения флуоресцентно-меченного основания, позволяют детектировать сигнал от отдельного нуклеотида, после чего терминатор удаляется;
  • для приготовления shotgun-библиотек имеется специально разработанный набор реагентов Nextera для фрагментирования ДНК на основе фермента транспозазы; метод пробоподготовки и проведения клональной амплификации — с ипользованием эмульсионной ПЦР или без использования эмульсионной ПЦР (на выбор);
  • необходимое количество ДНК образца для секвенирования — 50 нг (реагенты Nextera) / от 100 нг до 1 мкг (реагенты TruSeq) / от 1 нг геномной ДНК;
  • количество различных ампликонов, анализируемых за один запуск прибора — до 36’000;
  • обработка полученных данных осуществляется первоначально непосредственно ПО прибора и занимает от 2 ч (парно-концевые чтения 2×250) до 24 ч (метагеномный анализ по 16S РНК), после чего биоинформатическая обработка данных может осуществляться с помощью бесплатного защищенного облачного сервиса BaseSpace (порядка 8 ч), для которого требуется только доступ в Интернет.

Секвенирование нуклеиновых кислот — это определение их первичной нуклеотидной последовательности. Секвенаторы 2-го поколения, NGS, работают с негомогенной пробой, которая представляет собой смесь фрагментов ДНК в некотором интервале длин фрагментов с различной структурой нуклеотидных последовательностей (генетические библиотеки). Для осуществления генетического анализа на таком секвенаторе необходимо подготовить такую библиотеку.

В зависимости от поставленных задач, библиотека фрагментов может быть получена различными методами. Вот некоторые примеры:

  • статистическая фрагментация протяженных молекул ДНК (получение shotgun-библиотек), например, при полногеномном de novo секвенировании или ресеквенировании c целью получения с многократным покрытием прочтений перекрывающихся фрагментов и восстановлении данных о структуре протяженных участков (контигов) на их основе программными методами;
  • реакция обратной транскрипции с последующим фрагментированием для получения библиотеки кДНК с целью анализа транскриптомов и экзомов, то есть для получения информации о структурных генах и участках генома, с которых транскрибируется РНК;
  • метод ПЦР для получения ампликоновых библиотек, когда в качестве праймеров используются олигонуклеотидные наборы (панели), комплементарные целевым участкам, интересующим исследователя (например, проонкогенам) — библиотека получается обогащенной целевыми участками;
  • библиотеки «парных концов» (paired ends), получают с целью картирования исследуемой последовательности на референсной последовательности в случае ресеквенирования.

http://dia-m.ru/lab/analizatory-geneticheskie-sekvenatory-2-go-pokoleniya-ngs/illumina-11607-geneticheskij-analizator-miseq/